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    常見問題分析解決

    1. 熔解曲線出現多峰

    較為理想的熔解曲線是單峰曲線下載

    • 非特異性擴增
      引物設計不夠優化:根據設計原則設計新的引物??赏ㄟ^梯度PCR對引物退火溫度進行優化;
    • 出現引物二聚體
      引物設計不合理而導致的引物二聚體在熔解曲線內峰值一般位于75℃左右,如該峰顯著請按照以下方面進行優化:
      A.優化擴增條件,如提高退火溫度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟) 有利于強效擴增,因此引物設計時設定的成功退火溫度為60°C。
      B.引物濃度太高,適當降低引物濃度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數情況下,每條引物的理想最終濃度為200 nM,但如有需要,可將濃度降至60 nM。
      C.可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶,通常位于100 bp以下。在PCR過程中,二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨采用凝膠電泳分析進行驗證的缺點在于,其靈敏度最低僅達到納克級,因此可能無法得出結果。凝膠電泳分析的優勢是當解離曲線(熔解曲線) 數據同時可用時,產物的大小有助于對結果進行綜合解釋;
    • cDNA模板帶有基因組污染:重新制備cDNA模板。

    2. 擴增曲線形狀異常,如“S”型曲線

    • 反應體系引起的擴增曲線不光滑—擴增效率偏差(過高或過低)
      A. 擴增效率過高
      出現非特異擴增或引物二聚體:反應體系內模板濃度太高以及模板核酸質量較差(例如,如果采用硅膠柱純化時,結合DNA或RNA的離液鹽可抑制Taq DNA聚合酶。如果采用有機萃取法,則苯酚和乙醇殘余物也具有相同的效應),可能導致出現抑制PCR反應的現象。在絕對定量時表現擴增效率大于110%。
      解決方案:

      • 去除模板濃度最高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110% 以下,則分析良好;
      • 對目的基因做標準曲線,一般用克隆的該基因的質粒做梯度稀釋,或用PCR產物做梯度稀釋,然后做定量擴增,通過曲線評估反應效率。絕對定量有效的擴增效率在90%-110%;
      • 重新純化模板,去除模板中存在的潛在抑制物。切記應延長干燥時間,以去除乙醇沉淀過程中的乙醇,或采用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

      B. 擴增效率過低
      擴增效率過低主要表現在試劑濃度不適(主要是引物、鎂和Taq DNA 聚合酶,尤其是在多重實驗中),引物對Tm之間的差異超過5°C以及熱循環條件不適,試管中各種同源物質的競爭作用可造成反應效率低下。絕對定量表現:擴增效率<90%。
      解決方案:

      • 對上述因素逐一排除后進行調整優化實驗體系。

      C. 個別擴增曲線異常
      如個別擴增曲線突然驟降:反應管內留有氣泡,由于溫度升高后氣泡破裂,使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。進行擴增反應之前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。

    • 儀器設置不當引起的曲線異常
      • 基線設置不當,如擴增曲線斷裂或下滑:基線的終點值大于Ct值。減小基線終點 (Ct值- 4),重新分析數據;
      • 基線范圍和閾值設置不當。
        基線范圍和閾值都是人為設定的參數。二者一般由儀器自動默認為合適值。在對同一程序中的多種試劑盒或化學劑進行評估時,經常出現閾值設置不當造成不同組別數據的擴增曲線差異:軟件自動選擇的閾值更適合平臺更高的曲線 (下圖中的藍色曲線),這將導致此數據組中的紅色曲線的Ct值出現偏差,因為其最佳閾值比此值更低。因此,需對每個數據組進行獨立研究,這樣才能根據具體情形選擇最佳閾值;
      • Rox添加不當
        表現為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續,需校正參比染料。

    3. Ct值出現太晚

    • 擴增效率極低:優化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設計引物;
    • 模板濃度太低:減少稀釋度重復實驗;
    • 模板降解:重新制備模板,重復實驗;
    • PCR產物太長:一般將PCR產物長度設計為100 bp-150 bp之內;
    • 反應體系中存在PCR反應抑制劑:一般為加入模板時帶入,模板質量不高,參照【問題1.1】加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。

    4. 陰性對照也出現明顯擴增

    • 反應體系組分(如,水)被污染:實驗過程中,更換新的Mix或者水重復實驗;
    • 標本間的交叉污染或產物污染:反應體系在超凈工作臺內配制,對實驗室進行嚴格的區分,減少氣溶膠污染;使用帶濾芯的槍頭;
    • 引物二聚體的出現:一般在35循環以后陰性對照出現擴增屬正常情況,可配合熔解曲線,PCR產物的瓊脂糖電泳結果進行分析。

    5. 絕對定量時標準曲線線性關系不佳

    • 加樣誤差:加大模板稀釋倍數,提高加樣體積;
    • 標準品降解:重新制備標準品,重復實驗;
    • 模板濃度太高:增加模板稀釋倍數。

    6. 反應結束無擴增曲線出現

    • 擴增效率問題:電泳檢測qPCR反應產物,觀察是否有目的條帶的出現。如果沒有,則需要逐一排查引物、模板以及反應條件問題;
    • 確認引物是否降解:長時間未用的引物應先通過PAGE電泳檢測完整性,以排除引物降解的可能性;
    • 模板濃度太低或目標基因表達豐度過低:減少稀釋度重復實驗,一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。另外通?;虮磉_檢測所需的cDNA量為1到100ng。但是如果樣本中目的基因的豐富很低,可能就需要更多的樣本量。檢測一個樣本量的范圍,或者更理想的情況下加入陽性對照反應確認反應本身正常。如果對期望的表達水平不是很確定,可重新查詢文獻或NCBI Unigene 數據庫中EST表達數據來預估在不同組織中的表達水平;
    • 模板降解:重新制備模板,重復實驗;
    • 逆轉錄問題:
      與低表達量相關,如果目的基因在樣本中的豐度很低,需要增加實驗的靈敏度。確認一下qPCR反應中沒有加入過量的cDNA (最大加樣水平為 20% v/v),因為過量的cDNA樣本會引入抑制劑降低反應效率。也可以檢查一下逆轉錄酶和引物。隨機引物通常比基于oligo(dT) 的方法產生更多的 cDNA。另外,有些逆轉錄酶經過熱穩定性改造,也會提高cDNA產量。檢查反應中的各組分,通過優化各組分提高擴增效率;
    • 確認是否是程序設置不當:
      如是否設置了信號采集步驟:兩部法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在72℃延伸階段;
    • 確認了上述因素后排查是否反應循環數不夠:一般設置循環數為40,但需要注意的是過多的循環會增加過多的背景信號,降低數據可信度;
    • 實驗設計問題
      如果沒有見到任何擴增,還可能是引物/探針的設計并未針對正確的靶點。檢查序列數據庫如NCBI搜尋目的基因的不同變異型。有可能實驗設計只是針對了其中一種變異體,但是在所研究的樣本里并無表達。同時還要檢查引物/探針靶向的目的基因的區域,是在編碼區還是內含子?靶向5’UTR區域是不會檢查到轉染到細胞里的外源基因表達的 (因為5’UTR 區域是不會包含在表達載體質粒上的)。類似的情況,如果實驗設計是靶向內含子序列的,也是不會從cDNA 樣本中得到擴增的;
    • 產品儲存是否得到:
      該產品-20℃保存可以長期保持活性,推薦-20℃保存。4℃保存將會導致產品活性下降。因反復凍融也可能導致產品活性下降,因此當每次用量較小時,推薦小體積分裝后-20℃保存。

    7. 實驗重復性差

    • 加樣體積失準:使用性能較好的移液槍,擴大反應體積,將模板做高倍稀釋,以大體積加入反應體系中;
    • 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致:定期校準儀器;
    • 模板濃度太低:模板濃度越稀,重復性越差,減少模板稀釋度或提高加樣體積;
    • qPCR mix沒有完全混勻。請使用前充分混勻,
      重復性好的擴增曲線:重復性較理想的擴增曲線STD<0.2。

    8. 絕對定量中通過以下參數對qPCR結果加以判定—線性關系、擴增效率確認

    • 相關系數(R2):>0.98,越接近1,結果可信度越高。R>0.99或R2>0.98;
    • 標準曲線斜率:-3— -3.5,100%擴增效率對應的斜率是-3.32;
    • PCR擴增效率(E):90%-110%,越接近1,越理想。其對應的斜率為 -3.58至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1;
    • 檢測靈敏度確認:35Cycles內可得到好的定量結果,如果采用SYBR檢測方法,30cycles內無非特異性產物擴增;
    • NO template control (NTC)確認:35cycles 內無引物二聚體產生;
    • 重復性:STD<0.2。

    絕對定量和相對定量的差別?

    • 絕對定量目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數:
      相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數;
    • 絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標準品,必須做標準曲線:
      相對定量可以做標準曲線,也可以不做標準曲線;
      相對定量實驗有兩種方法:標準曲線法和Ct值比較法。如果使用標準曲線法,可以使用絕對標準品,也可以使用相對標準品,而且相對標準品在實驗操作上更為簡便易行。相對標準品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標準品,典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋。
     
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