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    PCR標準操作流程

    相關資料:PCR問題及提高PCR特異性方法總結

    本文介紹了PCR的詳細操作流程,強調了實驗中的注意事項,列舉了常用緩沖液的配方。幫助我們在理解實驗的基礎上更順利的操作。

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    聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外合成雙鏈DNA的一種方法,其原理類似于天然DNA的復制過程,其特異性主要依賴于與其目的片段兩端互補的特異引物和高特異性的酶。典型的PCR反應有三個步驟:變性,退火,延伸,經過多次循環反應,獲得目的片段。

    一.試劑準備

    1. DNA模板
    2. 特異性引物
    3. dNTP Mix
    4. PCR buffer
    5. 熱啟動酶

    二.操作步驟

    1.配置反應體系

    將各成分依次加入到0.5ml的離心管中

    試劑終濃度
    buffer1x
    dNTPs<0.4mM
    Forward primer<0.4uM
    Reverse primer<0.4uM
    Template DNA<100ng
    熱啟動酶5U
    ddH2OUp to 50 ul

    擴增使用熱啟動酶,可在常溫下操作,非熱啟動型的酶要在低溫配置反應體系。

    2.按照試劑盒說明書設置反應時間和溫度,擴增結束后電泳鑒定

    3.瓊脂糖核酸電泳

    • 將電泳所用器具蒸餾水洗凈,架好梳子
    • 根據要分離的DNA片段大小制備合適濃度的瓊脂糖凝膠,準確稱取一定的瓊脂糖加入到錐形瓶中,加入30ml左右的電泳緩沖液(TAE或TBE)
    • 在微波爐中加熱融化后冷卻至40℃左右,充分混勻后倒入電泳槽中
    • 室溫下凝固40分鐘左右,小心拔出梳子,將凝膠放置電泳槽中準備點樣
    • 在電泳槽中加入電泳緩沖液,漫過凝膠表面即可,點樣孔內不要有氣泡
    • 樣品點樣前準備好,(在八連管中)加入5ul樣品,1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合,用搶將混合后的樣品緩緩注入到點樣孔中,注意不要串孔
    • 按照正負極(紅正黑負),接通電源,電壓40-60V,時間30-40min,可根據溴酚藍的位置判斷是否終止電泳
    • 電泳結束,關閉電源,凝膠成像觀察,并對比marker確定片段大小

    不同的瓊脂糖濃度分離不同大小的DNA片段:

    瓊脂糖的濃度/%0.30.50.71.01.21.52.0
    DNA大小/kb5-601-300.8-120.5-100.4-70.2-30.05-2

    三.注意事項

    引物

    引物是決定PCR反應成敗的關鍵,要保證擴增的準確、高效,引物的設計要遵循如下原則:

    1. 引物的設計在cDNA的保守區域,在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析的軟件,得到不同基因相同的序列就是該基因的保守區
    2. 引物的長度:15-28bp,長度大于38bp,會使退火溫度升高,不利于普通Taq酶的擴增
    3. 引物GC含量在40%-60%,Tm值最好接近72℃
    4. 因密碼子的簡并性,引物的3’端最好避開密碼子的第三位(最好為T)
    5. 堿基分布錯落有致,3’端不超過3個連續G或C
    6. 引物自身不要形成發夾結構,引物設計完成,要BLAST驗證

    模板

    PCR擴增對模板的要求不高,單鏈、雙鏈DNA均可作為擴增片段,雖然PCR能夠擴增微量的DNA,為了保證擴增的特異性,對不同來源的模板,起始濃度有一定要求,如下:

    模板加入量
    λDNA100pg-100ng
    質粒DNA100pg-10ng
    大腸桿菌基因組DNA100pg-100ng
    人類基因組DNA10-200ng

    模板可以是純化后的樣品也可以是粗制品,不同來源的模板采取不同的處理方法,實驗模板的純化越簡單越好,但模板中如果含有任何的Taq酶抑制劑、蛋白酶、核酸酶等,會干擾反應。模板提取注意保存,不能放置太久,避免反復凍融并防止降解。多數人會忽略這一問題,當實驗結果沒有任何條帶時,可優先考慮是否為模板降解的原因。

    舉例:細菌DNA的提取方法

    1. 取1-2ml的菌液,12000rpm離心10min,去除上清,得到沉淀
    2. 根據得到沉淀量,加入500ul左右的TE(配方如下)懸浮沉淀,并加入20ul的溶菌酶,37度保溫30min
    3. 加入30ul 10%的SDS和1mg蛋白酶K,混勻后37度保溫1h
    4. 加入120ul 5mol/l氯化鈉,充分混勻,65度放置10min
    5. 等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)充分混勻,12000rpm離心5min,得上清于干凈的EP管中
    6. 等體積的氯仿:異戊醇(24:1)充分混勻,12000rpm離心5min,得到上清于趕緊EP管中
    7. 加入等體積的異戊醇,充分混勻,-20℃放置30min后10000rpm離心5min
    8. 去除上清,得到DNA沉淀用70%的乙醇漂洗(動作輕柔,不要將沉淀沖起),吸干,通??色@得3-5ug的DNA

    其他

    1. Taq DNA聚合酶:Taq酶種類有很多,熱啟動酶,高保真酶,根據各自實驗的應用選擇合適的酶擴增,一般的反應,化學修飾的熱啟動酶即能很好的完成,化學修飾熱啟動酶能夠避免低溫下任何非特異性產物產生。酶的濃度對擴增有一定影響,酶用量過多,會導致非特異性產物,操作按照說明書即可。
    2. dNTP:四種dNTP的濃度要相同,其中任何一種濃度偏高或偏低,都會引發堿基的錯誤滲入。此外,dNTP能夠和體系中鎂離子結合,從而影響體系中鎂離子的濃度。
    3. 緩沖液:緩沖液一般隨酶提供,一般的PCR試劑盒包括Taq酶,緩沖液,dNTP,水。初次擴增,可以完全按照試劑盒的說明書操作,如果擴增結果有問題,可自己嘗試摸索實驗條件或重新設計引物提取模板擴增。
    4. 因空氣中和手上有一定污染源,操作過程中要戴手套,在干凈的環境中配置反應體系,防止空氣中的污染源。
    5. PCR擴增的水要經過高壓滅菌或0.2um濾膜過濾。
    6. 產物切膠回收二次擴增前,要先鑒定,二次擴增模板稀釋1000倍。

    四.常用試劑配方

    電泳緩沖液

      1. 50xTAE(pH8.5)

    準確稱取Tris 242g,EDTA(Na)37.2g于1L燒杯中,加入800ml去離子水,攪拌溶解,接入57.1ml乙酸,充分攪拌,調pH值8.5后定容至1L,室溫保存。每次使用時稀釋即可。

      1. 10xTBE(pH8.3)

    準確稱取Tris 108g,EDTA 7.44g 硼酸55g于1L的燒杯中,加800ml去離子水,充分攪拌溶解,調pH8.3后定容至1L,室溫保存。每次使用前稀釋即可。

    上樣緩沖液

    6xLoding buffer

    0.25%二甲苯青,0.25%溴酚藍,30%甘油溶于雙蒸水中,4℃保存。

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