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    雜交瘤細胞克隆化的常用方法

    雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。下載因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆,在實際工作中,可能會有數個甚至更多的克隆,要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化??寺』姆椒ê芏?,有有限稀釋法、軟瓊脂法、單細胞顯微操作法、單克隆細胞集團顯微操作法和熒光激活細胞分類儀(FACS)分離法。這里介紹最簡單也是使用最廣泛的前兩種方法:

    有限稀釋法

    材料

    96孔細胞培養板、HT培養基、活力強的雜交瘤細胞、小鼠腹腔細胞

    方法

    1. 制備小鼠腹腔巨噬細胞(飼養細胞);
    2. 制備待克隆的雜交瘤細胞懸液,用含20%血清的HT培養基稀釋至每毫升含2.5、15、50個細胞3種不同的稀釋度;
    3. 按照每毫升加入5×104-1×105細胞的比例,在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞;
    4. 進行雜交瘤細胞96孔板分裝,每個稀釋度32孔,每孔量為0.2ml,每孔的雜交瘤細胞數分別為0.5、3和10;
    5. 37℃、7.5% CO2濕潤培養7-10天,出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體;在倒置顯微鏡下觀察,標出只有單個克隆生長的陽性孔,再次進行克隆
    6. 重復上述步驟3~5次,直至陽性孔率100%
    7. 進行抗體檢測、細胞胞擴大培養并凍存。

    說明:本法中(b)(c)(d)等步驟也可簡化為將計數后的雜交瘤細胞準確的進行系列稀釋,直至每毫升含10個細胞,按每孔接種0.1ml細胞懸液,即每孔含1個細胞。

    軟瓊脂法

    材料

    HT培養基(雙倍濃度)、小鼠腹腔細胞、滅菌平皿、活力很好的雜交瘤細胞、45℃水浴、2%瓊脂糖生理鹽水(用0.15mol/L NACl配置的2.0%瓊脂糖,稱取2.0g細胞培養用瓊脂糖,懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl,121℃高壓滅菌15分鐘,分裝10ml小瓶,冷卻后4℃保存)

    方法

    1. 在培養皿中制備單層飼養細胞(小鼠腹腔細胞);
    2. 臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養液混勻,配成1%瓊脂糖培養液,45%水浴中溫育;
    3. 制備雜交瘤細胞懸液:吸取平皿上層培養液,加入1%瓊脂糖培養液3ml,室溫10 min;
    4. 取雜交瘤細胞懸液1ml,加入1%瓊脂糖培養液1ml混勻,鋪于培養皿上層;
    5. 37℃、7.5% CO2濕潤培養7-14天,克隆生長至2mm時,用毛細吸管吸出克隆,直接轉種于含有飼養細胞的24孔板,擴大培養;
    6. 吸取上清,檢測抗體,陽性孔可繼續克隆化,或擴大培養、凍存。

    注意事項

    • 雜交瘤細胞的克隆化需盡早進行,避免其他細胞影響了抗體分泌細胞的生長。
    • 注意無菌操作,一旦發現污染必須及時處理。
    • 做克隆化培養的小牛血清必須是優質血清。
    • 每次克隆化得到的陽性亞克隆,在繼續進行克隆化或擴大培養的同時,應及時凍存幾支。

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