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    大腸桿菌表達系統

    本文主要介紹了大腸桿菌蛋白表達原理、具體操作步驟、大腸桿菌表達系統及其與其他系統的比較等。

    大腸桿菌蛋白表達原理

    誘導原理:Lac阻遏物是一種具有4個相同亞基的四級結構蛋白,都有一個與誘導劑結合的位點。在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態,Lac阻遏物能與操縱基因O結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,抑制轉錄起動。而當有誘導劑與阻遏蛋白結合后,其蛋白構象就發生變化,導致阻遏物從操縱基因O上解離下來,RNA聚合酶不再受阻礙,發生轉錄。詳情見IPTG誘導蛋白表達的原理
    下載

    大腸桿菌表達系統步驟

    不包括基因構建等上游操作和蛋白純化部分?;驑嫿▍⒖?a href="http://www.wholesaleclothingblog.com/gene-expression-optimization.html">密碼子優化,蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內容主要包括蛋白表達鑒定:
    1. ?表達鑒定第一天的任務,常用抗性選擇根據感受態細胞選擇

    • 拿到質粒,離心(3000r/min;2min)
    • 在質粒中加入TE(使質粒最終加入到110μL感受態細胞中的量為80-100ng,據此確定加入TE的量),一般為(1μg質粒加20μLTE;2μg質粒加50μLTE;5μg質粒加100μL?TE)
    • 將質粒與TE混勻,加入2μL混液于感受態細胞中
    • 將感受態細胞放入冰箱(4℃)中,30min
    • 取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激90s,
    • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
    • 拿出后取200μL的LB液體培養基加入到已轉入質粒的感受態細胞中
    • 放入搖床(37℃;??195r)中,??30nim至60min; (最佳45min)
    • 取出離心(3000r/min;2min)
    • 去掉200μL的上清,留100μL左右上清懸浮沉淀,吸取50μL懸液涂平板,(先將對應抗性的平板放入培養箱(37℃)中預熱20min)
    • 把平板放入培養箱(37℃),過夜(12h至16h)

    2. ?表達鑒定第二天的任務,注意Pcold的表達溫度

    • 每個平板挑取單菌落至4支對應抗性的L(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”
    • 將試管放入搖床(37℃;195r)中,(單抗3h左右;雙抗4左右;剛開始用可見分光光度計測OD值;熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)),測OD值(0.6至0.8)
    • 從“0”號管中取700μL懸液加入到100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存
    • 在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入2μL的IPTG(終濃度0.5mM最適)
    • 視不同的載體選擇適合的表達環境(PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達6h;37℃表達3h至4h(4支試管,“0”“1”號試管15℃表達過夜;“2”“3”試管37℃表達3h至4h)。Pcold:全部15℃表達過夜)

    3. 表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質的量及溶液黏度

    • 從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中,(若OD值不一樣,值小的可多?。╇x心(6000r/min),5min,?去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近)
    • 在每個離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min,?去上清,留沉淀
    • 在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading?Buffer懸浮沉淀(當溶質適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質多且粘稠時,應使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量)
    • 放入煮樣器(100℃)?25min
    • 取出后離心(6000r/min)??3min, ?電泳檢測。

    大腸桿菌表達系統

    大腸桿菌蛋白表達系統組成

    • 質粒載體:小型環狀DNA,能自我復制。一個完整的質粒載體必須要有復制起點、啟動子、插入的目的基因、篩選標記以及終止子;此外對大腸桿菌表達載體的要求是:①操縱子以及相應的的調控序列,外源基因產物可能會對大腸桿菌有毒害作用;②SD序列,即核糖體識別序列,一般SD序列與起始密碼子之間間隔7-13bp翻譯效率最高;③多克隆位點以便目的基因插入到適合位置。
    • 目的基因:在大腸桿菌表達體系中要表達的基因即外源基因,包括原核基因和真核基因;原核基因可以在大腸桿菌中直接表達出來,但是真核基因含有內含子不能,大腸桿菌不能對mRNA進行剪切,從而形成成熟的mRNA,所以真核基因一般以cDNA的形式在大腸桿菌表達系統中表達。此外還需提供大腸桿菌能識別的且能轉錄翻譯真核基因的元件。
    • 表達宿主菌:表達蛋白的生物體即大腸桿菌。表達宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達過程中是很重要的因素——多數人會直接選擇實驗室曾經用過的宿主菌,而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性,例如目的蛋白需要形成二硫鍵,可以選擇Origami?2系列,Origami能顯著提高細胞質中二硫鍵形成幾率,促進蛋白可溶性及活性表達;目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta?2?系列,補充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA?及CGG)稀有密碼子對應的?tRNA,提高外源基因的表達水平。
    大腸桿菌表達現象可能原因建議宿主菌
    無蛋白表達或出現截短蛋白密碼子偏移性Rosetta?2

    Rosetta gami?2

    Rosetta gami?B

    RosettaBlue

    細胞死亡,生長極困難基因產物為毒性蛋白pLysS?菌株
    蛋白無活性蛋白錯誤折疊Origami?2

    Rosetta gami?2

    Rosetta gami?B

    無克隆生長過高本底表達pLysS、pLysE?菌株

    大腸桿菌表達系統種類

    • T7大腸桿菌表達系統

    以T7啟動子、T7RNA聚合酶等T7噬箘體轉錄體系的元件為核心構建的表達系統。T7?RNA聚合酶一種高活性的RNA聚合酶,mRNA的合成速度比大腸桿菌內的RNA聚合酶快5倍,并某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶轉錄的序列也可以轉錄,所以T7?RNA聚合酶和T7噬箘體啟動子的存在的情況下,大腸桿菌本身的轉錄競爭不過T7噬箘體轉錄體系,最終受T7噬箘體啟動子控制基因的轉錄。

    • Lac和Tac大腸桿菌表達系統

    它是以大腸桿菌lac操縱子調控機理為基礎設計、構建的大腸桿菌表達系統,具有多順反子結構,結構排列為:

    啟動子(lacP)-?操縱基因(lacO)?–?結構基因(lacZ-lacY-lacA)

    原理:在無誘導物的情況下,負調節因子lacI基因產物形成四聚體阻遏蛋白與啟動子下游的操縱基因緊密結合,阻止轉錄的起始。加入誘導劑后,IPTG與lacI基因產物結合,使操縱基因解離出來,lac操縱子的轉錄因此被激活。用tac啟動子構建的表達系統稱為Tac表達系統。

    • PL和PR大腸桿菌表達系統

    以啟動子PL、PR為核心構建的表達系統。PL和PR表達系統具有很強的啟動轉錄能力,誘導時不需要加入化學誘導劑,成本低廉,但在熱刺激過程中,大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會被激活,降解所表達的外源蛋白;其次是在大規模發酵培養菌體時,通過熱平衡交換方式提高溫度,需要較長的時間,這會降低誘導效果,從而對重組蛋白的表達量有影響。

    此外還有其他表達系統,如pH調控型、營養調控型、糖原調控型等。

    大腸桿菌表達系統比較

    種類優點缺點
    T7大腸桿菌表達系統目的基因的表達水平高較高的本底表達
    Lac表達系統易于調控和操作對表達和制備用于醫療的重組蛋白不適合
    Tac表達系統易于調控,轉錄水平高于lac對表達和制備用于醫療的重組蛋白不適合
    PL和PR表達系統不需要加入化學誘導劑,成本又低廉,轉錄能力強可能降解所表達的重組蛋白,不適合大規模培養

    大腸桿菌與其他表達系統比較

    表達系統優點缺點
    大腸桿菌表達系統大腸桿菌表達系統具有表達背景清楚,表達水平高,操作簡單,培養周期短,抗污染能力強表達真核基因只能用其cDNA,不能進行翻譯后的修飾加工,含有大量內毒素
    哺乳動物表達系統可以使蛋白正確折疊,提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等加工修飾,更接近于天然蛋白產率低,某些糖基化產物不穩定、不易純化,費用昂貴
    酵母表達系統使用簡單,表達量高,可大規模生產,與原核相比可對異源蛋白修飾酵母表達蛋白有時會出現蛋白切割問題。
    昆蟲表達系統高效表達,完善的加工修飾,易從無血清上清中純化蛋白,無內毒素外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的調控之下,由于病毒感染,細胞開始死亡,無法進行連續性表達

    相關頁面

    原核表達常見問題(主要包括蛋白不表達,蛋白表達不在上清,包涵體復性解決等相關問題)。

     
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