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    細胞轉染方法比較

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    摘要:對哺乳動物細胞轉染表達蛋白來說,選擇合適的轉染方法和轉染試劑對轉染的成功率起到決定性作用。本文主要列舉了瞬時轉染和穩定轉染的一些方法、原理及適用性,并列舉脂質體細胞轉染的步驟、注意事項。

    細胞轉染,是指將外源基因導入細胞內的一種技術。根據哺乳動物細胞蛋白表達流程,細胞培養完成后需進行細胞轉染,根據不同的實驗目的選擇不同的轉染方法。目前,常用的細胞轉染方法主要分為三類途徑:物理介導(電穿孔法,基因槍法、顯微注射法)、化學介導(脂質體轉染法、磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物介導法)、生物介導(病毒介導轉染、原生質體轉染)。

    理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。目前實驗室常用的轉染方法有脂質體轉染,陽離子聚合物轉染和病毒轉染,不同的轉染方法各有利弊,針對細胞的習性和不同的實驗目的選擇相對合適的轉染方法。下面列舉了一些常用轉染方法的原理,優缺點和適用性:

    細胞轉染方法比較

    細胞轉染方法細胞轉染原理主要特點
    陽離子脂質體轉染法帶正電荷的脂質體靠靜電作用和DNA結合形成DNA-脂質體復合物,然后通過細胞的內吞作用進入細胞a)操作簡便
    b)適用于各種裸露的DNA和RNA片段
    c)適合轉染各種的細胞
    d)對DNA濃度有一定要求
    e)對細胞有一定的毒性
    瞬時轉染
    穩定轉染
    所有細胞
    陽離子聚合物帶正電的陽離子聚合物與核酸的磷酸基團形成帶正電的復合物,復合物和帶負電的細胞膜接觸,并通過內吞作用進入細胞與脂質體轉染法類似,但是具有很低的毒性,操作簡單,適用性廣,是新一代轉染試劑瞬時轉染
    穩定轉染
    所有細胞
    磷酸鈣法磷酸鈣能夠促進外源DNA和細胞的結合,磷酸鈣-DNA復合物能夠附著到細胞表面,并通過內吞作用進入細胞a)操作簡單
    b)對DNA濃度要求高
    c)適用性有局限(不適用于原代細胞)
    瞬時轉染
    穩定轉染
    電穿孔法高脈沖的電壓破壞細胞膜,在細胞膜表面形成孔道,DNA通過孔道進入細胞a)適用性廣,適用于質粒和幾十kb的基因組片段
    b)針對不同細胞要優化實驗條件
    c)細胞致死率較高
    瞬時轉染
    穩定轉染
    所有細胞
    顯微注射法利用顯微操作系統和顯微注射技術將DNA直接注入到細胞中a)整合率較高,適用于工程改造和轉基因動物的建立
    b)操作復雜,且需要昂貴精密的設備
    c)外源基因的整合位點和拷貝數無法控制,會導致片段缺失、突變
    瞬時轉染
    穩定轉染
    逆轉錄病毒轉染通過病毒的膜蛋白和細胞表面的受體相互作用而進入細胞,利用宿主細胞酶自行轉錄復制合成DNA,并隨機整合到細胞基因組中a)轉染效率高,適用于難轉染細胞轉染
    b)利用病毒介導轉染,外源基因整合較穩定
    c)逆轉錄病毒只選擇感染分裂細胞
    d)容納外源基因長度<8kb
    穩定轉染
    特定細胞轉染

    脂質體轉染步驟

    1. 細胞培養:細胞鋪板,加入一定量的細胞培養液,37℃二氧化碳培養箱中培養,待細胞密度生長至80-90%時,準備轉染。
    2. 在EP管中,加入無血清稀釋的轉染試劑,室溫放置5min
    3. 在EP管中,加入無血清培養基稀釋的DNA,室溫放置
    4. 5min,并將二三步得到的兩物質混合得到C液,輕輕混勻,室溫下放置15-30min。
    5. 用無血清培養基將細胞洗滌兩次,在細胞中加入適量的無血清培養基
    6. 將混合得到的C液緩緩加入到細胞中,搖勻,在37℃的二氧化碳培養箱中培養6-24小時。
    7. 細胞培養6-24小時后,吸去無血清轉染液,加入正常培養液繼續培養

    注意事項:

    1. 轉染是不能使用含有血清的培養液,血清對轉染效率影響很大
    2. 轉染前鋪板時用無雙抗培養基,抗性的增加會影響轉染效率
    3. 鋪板24小時內進行轉染
    4. 整個操作過程輕柔,避免劇烈震蕩

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