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    鼠單抗制備 兔單抗制備 雜交瘤測序 蛋白表達

    重組抗體表達實驗案例

    概述:本文為重組抗體表達案例介紹,介紹了完整的重組抗體表達實驗流程,包括實驗設計、質粒抽提、CHO細胞復蘇、CHO細胞轉染、重組抗體純化及穩定性檢測等實驗步驟及各個步驟的詳細操作流程。

    第一部分 實驗設計

    該案例為德泰生物重組抗體表達服務的一個項目,采用德泰生物最新開發的密碼子優化軟件MaxCodonTM Optimization Program (V13)對提供的重組抗體H(以下簡稱rAb-H)蛋白氨基酸序列進行優化,采用全基因合成并通過雙酶切法將將rAb-H基因插入到表達載體proEM中,并通過酶切法和測序確認最終表達載體的準確性,最終轉到DH5a克隆菌株中,通過質粒大抽試劑盒提取轉染級質粒,之后將質粒通過轉染試劑轉染到哺乳動物細胞CHO中進行瞬時表達,在通過Protein A親和層析純化rAb-H蛋白。

    第二部分 重組抗體rAb-H在哺乳動物系統中表達與純化

    一、轉染級質粒擴增抽提

    1. rAb-H質粒轉化DH5a
      • 分別吸取rAb-H的Light Chain和Heavy Chain表達質粒80-100ng加入已制備的DH5a感受態細胞中;
      • 將加入質粒后的感受態細胞通過熱激42℃,90s轉化;
      • 將轉化后的感受態細胞加入 LB液體培養基,放入搖床37℃,200rpm震蕩培養約30nim;
      • 將培養后的感受態細胞取出,吸取部分懸液涂在含有氨芐抗性的平板上,放入培養箱,37℃,過夜培養;
      • 從新鮮的培養板中挑取單克隆于2-5mL?LB培養基,37℃,200rpm培養8h;
      • 按1/500比例接種于200mL LB培養基中,37℃,200rpm培養16h;
      • 收集培養后的菌液離心,去掉上清.
    2. rAb-H質粒抽提(Qiagen轉染級質粒抽提試劑盒)
      • 1%瓊脂糖凝膠分析抽提的rAb-H質粒,結果如下:
        case-s
      • 轉染級質粒DNA質粒質量測定
    檢測內容轉染級質粒標準Light Chain質粒檢測結果Heavy Chain質粒檢測結果
    A260/A2801.8-2.01.861.85
    內毒素內毒素<50EU/mg鱟試劑檢測,<50EU/mg鱟試劑檢測,<50EU/mg
    無菌檢測無菌LB平板檢測,無菌落LB平板檢測,無菌落

    二、CHO細胞復蘇與傳代

    • 提前將水浴鍋打開37℃;培養基提前在37℃預熱;
    • 從液氮罐中取出凍存的CHO細胞;
    • 把凍存細胞立即投入37℃水浴鍋中,輕微搖動使其快速融化(約1min),取出;
    • 用75%乙醇消毒管外壁,放入生物安全柜內,轉移到含10mL培養基的 15mL離心管中,離心800 rpm,5 min;
    • 離心后的細胞去掉上清,取少許新鮮培養基重懸細胞,再轉移到培養瓶中,加入新鮮培養基輕輕搖動,使細胞分散均勻,取細胞計數及活力檢測,使密度控制在3-4×105 cells/mL,活力>95%;
    • 置于培養箱中110rpm,37℃,5% CO2培養;
    • 細胞培養2-3天,密度達到2.0×106 cells/mL 左右時需對細胞進行傳代;
    • 從培養瓶中取出部分培養物棄掉,再向培養瓶中補加新鮮培養基,對剩余的細胞培養物稀釋(留下的細胞培養物根據細胞密度、培養體積、稀釋后密度等而定);
    • 放入培養箱中110rpm,37℃,5%CO2,繼續培養;
    • 每天需對細胞密度及活力檢測,當細胞密度達到2×106 cells/mL左右時,要對細胞進行傳代;

    三、rAb-H質粒轉染CHO細胞

    • 轉染前2天將CHO細胞懸浮培養至1.5 L,接種密度為4 – 5×105 cells/mL,置于培養箱中110rpm,37℃,5% CO2培養;
    • 轉染當天使細胞密度控制在1.5-2×106 cells/mL;
    • 將轉染緩沖液、轉染試劑等試劑提前放入培養箱或水浴鍋37℃預熱(10-20min);(轉染方法介紹
    • DNA-轉染試劑混合物:向轉染緩沖液中加入Light Chain和Heavy Chain表達質粒和轉染試劑混勻,37℃溫育10min;
    • 將DNA-轉染試劑混合物加入待轉染細胞中,放入培養箱中110rpm,37℃,5%CO2培養;
    • 收集:轉染后約5-6天,取出細胞培養物,離心,收集上清或細胞;

    四、rAb-H 純化

    • 取轉染培養6天后的細胞培養液離心,上清用0.22um膜過濾,在4℃環境下透析至緩沖液20 mM Na2HPO4,150 mM NaCl,pH 7.0中,透析結束后再用Protein A柱純化,結果如下:fig2
      經Protein A親和層析純化,目標蛋白rAb-H主要存在于洗脫組分Lane 4-6中,收集上述目標蛋白,并將其透析到1XPBS, 10% Glycerol, pH7.4中,透析結束后用0.22um膜過濾,并分裝凍于-80℃

    第三部分 重組抗體rAb-H蛋白質檢

    1. rAb-H穩定性測試(凍融實驗)
    2. 取一支分裝后凍于-80℃的rAb-H蛋白,放置于冰水混合物中待其緩慢融化,融化后無異?,F象,說明rAb-H蛋白凍融實驗是正常的。

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